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細胞培養(yǎng)知識(一)

發(fā)布日期: 2013-08-27
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冷凍管應如何解凍? 
取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在分鐘內(nèi)全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。 

細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時, 是否應馬上去除DMSO? 
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基? 
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基, 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。 

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類? 
不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源, 所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。 

何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
 
培養(yǎng)細胞時應使用5 % 10% CO2?或根本沒有影響? 
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng), 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2;當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。

何時須更換培養(yǎng)基? 
視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。
 
培養(yǎng)基中是否須添加抗生素? 
除于特殊篩選系統(tǒng)中外, 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下, 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。
 
附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理? 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于-20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。 

10 
懸浮性細胞應如何繼代處理? 
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養(yǎng)液太多時, 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶, 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。 

11 
欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速?
欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (1,000rpm)5 - 10 分鐘, 過高之轉(zhuǎn)速, 將造成細胞死亡。 

12 
細胞之接種密度為何? 
依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 

13 
細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何? 
動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。 

14 DMSO 
之等級和無菌過濾之方式為何? 
冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture gradeDMSO (Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì), 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO Nylon 材質(zhì)濾膜。 

15 
冷凍保存細胞之方法? 
冷凍保存方法一冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘 (-20 °C30 分鐘*)  -80 °C 16~18 小時或隔夜)  液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C -80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。 

16 
細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度?
 
冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

17 
應如何避免細胞污染? 
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。 

18 
如果細胞發(fā)生微生物污染時,應如何處理? 
直接滅菌后丟棄之。 

19 
支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀? 
不能。除極有經(jīng)驗之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株, 無法以其外觀分辨之。 

20 
支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響? 
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù), 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。 

21 
偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。 

22 CO2 
培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔? 
定期至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。 

23 
為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, pH值會越來越偏堿性? 
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時, 可以通入無菌過濾之CO2, 以調(diào)整pH 值。 

24 
各種細胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同? 
不同廠牌的dish flask 其所coating polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響, 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish flask 而有顯著之生長差異。 

25 
購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形? 
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤, 造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 

26 
購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因? 
研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后, 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于-80 °C 太久。 

27 
收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因? 
冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

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