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hot news1 冷凍管應如何解凍?
取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。
2 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時, 是否應馬上去除DMSO?
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基, 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。
4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?
不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源, 所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
6 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng), 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2;當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。
7 何時須更換培養(yǎng)基?
視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。
8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?
除于特殊篩選系統(tǒng)中外, 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下, 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。
9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理? 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于-20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。
10 懸浮性細胞應如何繼代處理?
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養(yǎng)液太多時, 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶, 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。
11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速?
欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉(zhuǎn)速, 將造成細胞死亡。
12 細胞之接種密度為何?
依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
13 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?
動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。
14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?
冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì), 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。
15 冷凍保存細胞之方法?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。
16 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度?
冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
17 應如何避免細胞污染?
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。
18 如果細胞發(fā)生微生物污染時,應如何處理?
直接滅菌后丟棄之。
19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?
不能。除極有經(jīng)驗之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株, 無法以其外觀分辨之。
20 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響?
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù), 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。
21 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。
22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, 且pH值會越來越偏堿性?
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時, 可以通入無菌過濾之CO2, 以調(diào)整pH 值。
24 各種細胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同?
不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響, 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
25 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形?
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤, 造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?
研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后, 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于-80 °C 太久。
27 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?
冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。